在小腦中，攀爬纖維（CFs）為平行纖維到浦肯野細胞突觸的監督學習提供指導性信號。 迄今為止，尚未測試CF信號是否也可能影響其他腦區的可塑性。 本文顯示，在清醒小鼠中，光遺傳學CF激活抑制了在重複鬍鬚刺激后觀察到的初級體感皮層（S1）中L2/3錐體細胞鬍鬚反應的強化。 利用雙光子成像和化學遺傳學，我們發現CF通過調節S1皮層中的SST和VIP陽性中間神經元來控制可塑性。 跨突觸標記確定未定帶（ZI）到丘腦後內側核的投射是小腦輸出到達S1皮層的通路。 化學遺傳學抑制ZI中的PV陽性神經元可防止CF共激活效應，確定ZI為關鍵中繼站。 我們的研究結果表明，CF影響S1皮層中的感覺信號處理和可塑性，因此可能傳遞指導性信號。
引言
感覺體驗和學習與多個腦區的可塑性相關。 新皮層可塑
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性通常依賴於其直接輸入結構的活動¹。 例如，啮齒動物初級體感皮層（S1皮層）的鬍鬚區域可塑性在重複鬍鬚刺激后被誘發。 鬍鬚剪除²⁻⁴或節律性鬍鬚刺激史⁵⁻⁷後，感受野圖可能重組，這需要突觸權重的適應性可塑性，例如通過錐體神經元突觸輸入上的長時程增強（LTP）和/或長時程抑制（LTD）⁸，⁹。 S1感覺迴路的高度可塑性使適應改變的輸入成為可能¹⁰。 儘管新皮層的經驗依賴型可塑性對輸入特徵高度敏感，但其他腦區的調節影響可能發揮作用。
小腦的功能越來越多地被賦予先前歸因於新皮層的功能¹¹，¹²。 它通過丘腦向運動皮層和非運動區域投射，包括前額葉皮層¹³，¹⁴、感覺和聯合區域¹⁵⁻¹⁷。 因此，小腦輸出影響皮層信號是一個合理的可能性。 確實已經證明，小腦輸出的調節會影響前額葉皮層的活動¹⁸、新皮層區域之間神經振蕩的相幹性¹⁹⁻²¹以及頂葉-運動皮層連接的可塑性²²。 然而，這些相互作用的細胞機制尚未被描述。
本文我們提出一個具體問題：小腦攀爬纖維（CF）信號是否具有影響新皮層可塑性的機制能力。 我們研究CF信號的動機源於其活動對正常小腦功能的重要性，在小腦中，CF控制的可塑性是大腦監督學習的經典例子¹。 根據樹突結構，浦肯野細胞（PCs）接收來自一個或多個攀爬纖維（CFs）的輸入²³，這些纖維起源於對側下橄欖核（IO）。 正如Marr在其《小腦皮層理論》中最初預測的那樣，CF信號監督平行纖維（PF）–PC突觸上的可塑性，為學習提供"上下文"²⁴。 後來的實驗表明，PF和CF共刺激在PF突觸上引發LTD²⁵⁻²⁸，並且CF–通過誘發鈣瞬變–緊密控制這些突觸上的可塑性²⁹⁻³⁴，併為小腦控制的學習提供指導性信號³⁵⁻³⁸。 CFs提供指導性錯誤信號³⁹，跨模態傳遞感覺輸入⁴⁰⁻⁴⁴，甚至可能傳遞預期感覺信號缺失的信號⁴⁵。 CFs還可能攜帶獎勵或獎勵預測相關信號⁴⁶，⁴⁷。 CF被招募的上下文繼續被識別，這強調了確定它們是否可能影響新皮層活動和可塑性的重要性。
為確定CF信號是否具有影響S1神經元可塑性的能力，我們使用小鼠腦在細胞水準上提供實驗通路。 我們觀察到CF信號調節S1皮層中L2/3錐體細胞的可塑性，表明橄欖-小腦系統的活動對S1皮層中的輸入處理和可塑性具有不同的後果，並顯著擴展了關於這些區域之間基本相互作用的已知知識。 這種機制可用於向新皮層提供指導性信號，取決於CF被招募的上下文，類似於在小腦監督學習中起作用的信號。
經驗依賴型S1皮層可塑性受光遺傳學CF激活調控
為研究CF活動對S1可塑性的影響，我們在S1皮層中表達了GCaMP6f，並在清醒小鼠中使用雙光子顯微鏡測量對L2/3 （L2/3）神經元鬍鬚區域空氣噴射刺激的反應（圖1A， D）。 為進行光遺傳學CF啟動，通道視紫紅質-2 （ChR2）在下橄欖核（IO）神經元中表達，這些神經元在對側小腦皮層終止（圖1B， E; 圖S1A， B）。 LED用於在以顱窗為中心的470nm光脈衝，該顱窗位於對同側鬍鬚區域刺激有反應的小腦皮層區域crus I/II⁴⁰。 通過在crus I/II的PCs中表達GCaMP6f並測量LED光脈衝誘發的鈣瞬變來測試光遺傳學啟動的效果，我們改變頻率和持續時間以實現類似於自發CF瞬變的光遺傳學誘發信號（圖1C; 圖S1F）。 持續50ms的單光脈衝誘發了CF瞬變，其振幅或峰值潛伏期與在同一PCs中記錄的自發事件無顯著差異（圖S1H， I）⁴⁸。 為誘導S1皮層中的可塑性，我們使用了多鬍鬚刺激方案（"節律性鬍鬚刺激"; RWS），類似於先前用於研究體內感覺驅動突觸可塑性的方案⁷，⁹，⁴⁹，⁵⁰。 這裡，RWS由對對側鬍鬚區域應用100ms空氣噴射（8psi）組成，持續5分鐘，頻率為8Hz，這是小鼠採樣環境時的自然鬍鬚頻率⁵¹。 RWS刺激導致鬍鬚誘發鈣反應增加（刺激起始後0-700ms範圍內的ΔF/F），我們在形態學鑒定的L2/3錐體神經元（PNs; 圖1F）中觀察到這一現象，持續記錄時間（60分鐘RWS后; 圖1G-I）。 用GCaMP6測量的胞體鈣反應振幅與神經元放電率相關⁵²。 L2/3錐體神經元對相應主鬍鬚的刺激有反應，但也可能對周圍鬍鬚的刺激有反應⁵³。 因此，這裡觀察到的對多鬍鬚刺激的可塑性可能反映了傳遞已存在鬍鬚輸入的突觸強化以及神經元感受野擴展到包括額外周圍鬍鬚。 鑒於興奮性神經元活動的增加可能與局部抑制性神經元活動的減少耦合在這種形式的可塑性中⁵⁴，我們還在同一隻小鼠中評估了未鑒定為錐體細胞的神經元（即假定的中間神經元; INs）的反應。 確實，INs整體對RWS刺激表現出誘發鈣事件振幅的顯著抑制（圖1J-L; 圖S2F， G）。 由於副蛋白鈣素（PV）陽性中間神經元、生長抑素（SST）陽性中間神經元和血管活性腸肽（VIP）陽性中間神經元分別約佔新皮層中間神經元群體的40%、30%和12%⁵⁵，⁵⁶，這種可塑性效應可能主要由SST和PV中間神經元組成。 使用轉基因小鼠將SST和PV中間神經元標記為tdTomato，我們證明RWS導致SST和PV中間神經元顯著抑制（圖S2H， I）——與我們在假定中間神經元中的觀察一致。
為確定CF與鬍鬚刺激共啟動是否影響這種形式的經驗依賴型可塑性，在5分鐘重複鬍鬚刺激（RWS+CF）期間，以1Hz的頻率遞送50ms光脈衝，這是自發CF放電的速率³⁹。 每個光脈衝相對於鬍鬚刺激起始延遲45ms遞送，類比CF對鬍鬚刺激的自然潛伏期⁴⁰。 RWS+CF阻斷了S1皮層中L2/3錐體細胞反應的強化，並觀察到抑制（圖1G-I; 圖S2D， E）。 在RWS后觀察到的IN反應抑制在光遺傳學CF共啟動時消失（圖1J-L，圖S2F， G），而在tdTomato標記的SST和PV中間神經元的小鼠中進行的記錄進一步證明瞭抑制性中間神經元抑制的消失（圖S2H， I）。 重要的是，S1可塑性和光遺傳學CF激活效應在包含小鼠主動運動的試驗中（圖1; 圖S2+3）或當分析僅限於小鼠在刺激起始前和整個反應期間都處於休息狀態的試驗時（圖S3）都被觀察到。 注意休息期間鬍鬚的運動不存在。
為測試這些效應的穩健性，我們使用另一種適合檢測感受野（包括S1皮層中的鬍鬚桶）的方法重現了這些發現。 固有光學成像⁵⁷用於在麻醉小鼠中以低空間解析度測量可塑性效應，以促進單鬍鬚反應的測量。 我們將玻璃移液管滑過單個未修剪的鬍鬚，並以10Hz的頻率來回移動5分鐘。 在對側S1皮層的鬍鬚桶區域中，我們確認了相應桶的啟動，並在重複刺激前20分鐘和之後30分鐘記錄了對這種被動感覺體驗的反應。 我們觀察到響應區域增加超出了桶，這在沒有重複刺激的情況下未被觀察到（圖S4）。 當小腦crus I/II中表達ChR2的CFs在重複刺激期間以1Hz的頻率光遺傳學啟動5分鐘時，S1皮層中未觀察到這種可塑性（圖S4）。 因此，固有光學成像證明鬍鬚桶的感受野可塑性可由小腦信號調控。
綜合起來，我們的研究結果表明，S1皮層中的鬍鬚誘導反應強化源於L2/3錐體細胞可塑性。 局部抑制性中間神經元在同一隻動物中表現出相反方向的可塑性。 觀察到這種IN可塑性振幅較低且不完美地鏡像錐體細胞可塑性，表明前者支持後者並可能説明控制它，但錐體細胞LTP可能在沒有IN神經元LTD的情況下發生。 CF活動調控這種鬍鬚圖可塑性。 注意這裡的"LTP"和"LTD"反映了靶神經元的反應性——通過神經鈣信號測量——並未特別顯示為突觸增益變化。
CF啟動調節S1皮層中的抑制性中間神經元
局部抑制性中間神經元調控新皮層錐體神經元的活動和可塑性，這一現象在啮齒動物鬍鬚桶皮層中被廣泛研究⁵⁶。 因此，為識別光遺傳學CF啟動對S1可塑性門控效應的潛在介質，我們接下來確定S1迴路中特定神經元類型的基本鬍鬚反應特性在CF共激活期間如何改變（圖2A）。 首先，我們證明在檢查的L2/3錐體神經元群體中，這些基本反應在光遺傳學CF啟動後沒有顯著改變（圖2B; 0-700ms分析視窗）。 然而，我們發現，在23隻小鼠中的11隻中，CF共激活導致整體反應降低，而在23隻小鼠中的5隻中觀察到增加（使用10%閾值）。 在選擇晚期分析視窗時（650-850ms，選為峰值后反應的早期成分），觀察到的輕度反應降低的顯著性出現。 這些發現表明CF共激活導致L2/3錐體神經元群體中一系列反應變化，但整體抑制效應在晚期反應階段變得明顯。
在同一隻小鼠中，CF共啟動增加了INs對鬍鬚刺激的基本反應（圖2C）。 與在IN群體中測量的可塑性效應類似（圖1J-L），這些基本反應增加可能主要由PV和SST中間神經元組成。 使用tdTomato標記的中間神經元來鑒定SST和PV中間神經元（圖2D-F），我們證明CF共啟動后SST和PV中間神經元確實增強了對鬍鬚刺激的基本反應（圖2G-I）。 VIP中間神經元——主要抑制包括SSTs和PVs在內的其他中間神經元⁵⁶——在預設分析視窗（0-700ms; 圖2G）中CF共啟動后對鬍鬚刺激的基本反應沒有一致變化。 然而，與錐體神經元類似（圖2B），VIPs在650-850ms的晚期分析視窗中表現出顯著抑制（圖2G）。
SST和VIP中間神經元在CF介導的S1可塑性控制中的相反作用
由於SST中間神經元被CF共激活激活，我們測試它們是否在CF介導的S1可塑性調控中承擔關鍵角色。 為此，我們接下來使用化學遺傳方法進行活動操作。 我們專注於SST中間神經元，因為它們接觸L2/3錐體細胞的樹突（圖3A， E），其中抑制可以影響局部突觸可塑性過程。 我們首先在新皮層SST中間神經元中表達興奮性hM3D（Gq） DREADD（圖3B）。 通過腹腔注射給予DREADD激動劑去氯氯氮平（DCZ）導致SST中間神經元反應增加（圖3C）。 在此條件下，RWS未使L2/3錐體細胞反應強化，反而導致鈣信號抑制（圖3D），類比光遺傳學CF共激活的結果（圖1G-I）。 相反，在SST中間神經元中表達抑制性hM4D（Gi） DREADD（圖3F）並急性給予DCZ導致SST中間神經元反應顯著降低（圖3G）。 當RWS與CF共啟動配對時，這挽救了L2/3錐體細胞反應的強化（圖3H）。 這些發現證實SST中間神經元能夠控制L2/3錐體神經元的可塑性⁹，並表明該機制被CF共啟動招募。
SST中間神經元接收來自皮層和向S1提供輸入的皮層下區域的相對較弱輸入，但被VIP中間神經元強烈抑制（圖4A， E）⁵⁸，⁵⁹。 在RWS期間，VIP中間神經元可能抑制SST活動，從而促進可塑性⁹，⁶⁰。 我們上面已顯示光遺傳學CF啟動降低了對鬍鬚刺激有反應的VIP中間神經元子集（圖2G）。 為檢查這種活動調控對RWS+CF誘導的L2/3錐體細胞可塑性抑制是否至關重要，我們使用化學遺傳方法操作VIP中間神
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經元的活動。 我們首先觀察到在VIP中間神經元中表達抑制性hM4D （Gi） DREADDs（圖4B）並急性給予DCZ顯著降低了VIP中間神經元的活動（圖4C），並阻止了單獨RWS刺激后的S1強化（圖4D）。 這種操作類似於RWS+CF（圖1G-I）或RWS期間SST啟動的效果（圖3D）。 相反，在VIP中間神經元中表達興奮性hM3D（Gq） DREADDs（圖4F）並急性給予DCZ增強了VIP中間神經元的反應（圖4G），並在配對RWS和光遺傳學CF啟動（RWS+CF; 圖4H）后挽救了S1可塑性，類比RWS（圖1G-I）或RWS+CF期間SST中間神經元活動抑制的效果（圖3H）。
為控制DCZ的持續存在，對每種條件進行了相同的實驗，但不給予RWS（圖S5A， D）或RWS+CF（圖S5G， J， M）。 比較對照和可塑性實驗時，SST啟動和VIP失活實驗都成功顯示SST啟動足以阻斷RWS介導的PN強化（圖S5C），而VIP活動對RWS介導的PN強化是必需的（圖S5F）。 VIP激活實驗也成功顯示VIP啟動在RWS+CF后挽救了PN強化（圖S5O），並且這種效果不是由於在這些條件下DCZ存在導致的錐體神經元反應性持續增加（圖S5N）。 我們還測試了PV中間神經元對CF介導的S1可塑性控制的潛在貢獻。 在PV中間神經元中表達抑制性hM4D （Gi） DREADDs確實在與對照比較時在RWS+CF後挽救了PN強化（圖S5L），鑒於PV中間神經元通常是具有強自發放電連接到錐體神經元的籃狀細胞，這是一個強有力的效果⁵⁶。 為支援我們的解釋，即VIP中間神經元控制S1皮層中的去抑制網路，我們進一步分析了VIP化學遺傳操作實驗中的IN群體（由假定的SSTs和PVs組成）（圖5）。 RWS期間VIP失活阻斷了PN強化（圖4D），確實導致IN活動相應增加（圖5C），以類比RWS+CF的效果（圖1G-L），即使沒有CF活動。 RWS+CF期間VIP啟動挽救了PN強化（圖4H），導致IN活動相應降低（圖5F），以類比RWS的效果（圖1G-L），即使CFs活躍。 這些發現證實VIP中間神經元協調S1皮層中的抑制網路，並表明該機制被光遺傳學CF啟動招募。 綜合起來，到目前為止呈現的研究結果表明，RWS驅動的可塑性的關鍵迴路位於S1皮層本身，並確定VIP和SST中間神經元是足以介導CF激活後果的效應器。 充分性的概念不排除在此上下文和其他未測試的上下文中可能調節效應器啟動的其他可塑性過程的潛在效果。