腫瘤微環境中的細胞間通信對治療結果有重大影響。 特別是高度侵襲性癌症，如膠質母細胞瘤，通過開發對治療的抵抗力或滲透周圍組織以逃避放射治療而從有效的細胞通信中受益。 隧道納米管（TNTs）等微小膜隧道可作為腫瘤細胞的有效通信工具。 通過這些結構，細胞可以構建一個大型網路，使它們能夠儘快對環境做出反應並適應，從而對抗治療。 在本研究中，我們調查了化療藥物對U87 MG細胞中TNT網路的影響，以確定它們是否影響TNT的數量，進而影響可能的治療結果。 藥物對TNT穩定性的影響可能與其對肌動蛋白和微管蛋白的作用有關，這些是膜結構的已知穩定劑。 因此，我們還分析了U87 MG細胞中TNT的細胞骨架含量，並研究了肌動
女士催情藥 (https://longscity.com/product-category/woman1/) 延時噴霧劑 (https://longscity.com/product-category/man5/) 性用品周邊 (https://longscity.com/product-category/sex/) 治療性冷感 (https://longscity.com/product-category/woman4/) 淫蕩春藥水 (https://longscity.com/product-category/woman2/) 男士催情藥 (https://longscity.com/product-category/man3/) 男士助勃藥 (https://longscity.com/product-category/mens-erection-pills/) 男士持久藥 (https://longscity.com/product-category/mens2/) 補腎壯陽藥 (https://longscity.com/product-category/man4/) 迷昏失憶型 (https://longscity.com/product-category/woman3/) 陰莖增大丸 (https://longscity.com/product-category/man6/)
蛋白聚合抑製劑細胞鬆弛素B（CytoB）對TNT形成和網路的影響。 本研究中，CytoB減少了TNT的數量，表明肌動蛋白作為細胞骨架成分，對於開發TNT網路是必需的。 相比之下，化療藥物替莫唑胺（TMZ）和阿糖胞苷（AraC）不影響TNT和肌動蛋白含量。 由於TNT網路與某些腫瘤的治療抵抗性增加密切相關，我們認為目前膠質母細胞瘤治療中缺乏對TNT的抑制是一個主要問題，應成為未來進一步研究的目標。
背景
隧道納米管（TNTs）是直徑在納米範圍內的微小膜連接，連接遠距離的細胞。 這些細長的連接（長度可超過100 μm）是細胞間直接快速傳遞資訊或貨物的有效通信工具。 它們最早在2004年在大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞中被描述。 自發現以來，它們已在多種細胞系中被發現，包括2D細胞培養和組織中的癌細胞和正常細胞。 研究表明，TNTs可以運輸多種類型的貨物，包括鈣信號、死亡信號、細胞器、病毒等。 TNT研究顯示，這些膜隧道在不同細胞類型中表現出顯著的形態和功能多樣性。 然而，由於它們在促進細胞間快速交換方面的優勢特性，從而確保細胞對其環境的良好適應性，TNTs被認為在癌症治療中起著至關重要的作用。 特別是在具有高度異質性的癌症中，不同細胞亞克隆的相互作用和合作可以通過創建耐葯微環境而導致治療失敗。 研究表明，TNTs可以形成大型耐葯網路，並轉移促進治療抵抗的貨物，如線粒體、p-糖蛋白或miRNAs。 另一方面，幾份報告表明，納米顆粒也可以通過TNTs轉移，因此也可以考慮將TNTs用作藥物遞送系統。 TNTs可能為癌症治療提供新思路，特別是對於膠質母細胞瘤等非常侵襲性的癌症，其中對新治療方法的需求很高。
膠質母細胞瘤是最常見和最惡性的腦腫瘤，中位存留期少於15個月。 這種癌症的侵襲性是由於其高度異質性、大基因組改變、對周圍健康組織的高浸潤率以及對治療產生抵抗力的強能力所致。 膠質母細胞瘤的標準治療首先是儘可能手術切除腫瘤組織，然後進行放療和同時使用替莫唑胺（TMZ）進行化療。 膠質母細胞瘤的特徵是其浸潤性生長模式進入周圍健康腦組織，這使得完全手術切除具有挑戰性。 在放療過程中，健康組織區域內的浸潤性腫瘤細胞可能接受亞最佳輻射劑量，使它們能夠存活並繼續生長。 因此，化療代表了一種重要的補充治療方式，有可能更全面地靶向分散的腫瘤細胞。 對於膠質母細胞瘤的化療，通常使用烷化劑如TMZ。 然而，腫瘤經常在原發腫瘤附近復發，且對治療的抵抗力增強。 單個細胞之間的相互作用，特別是TNTs實現的有效細胞通信，可能導致對治療產生抵抗力的問題。
TNTs可能是理想的治療靶點這一假設在文獻中被廣泛討論。 然而，到目前為止，關於TNTs的知識非常有限。 它們在不同細胞類型中的巨大多樣性使得更難確定這些膜結構的關鍵點。 因此，它們與癌症的關係及其對新治療途徑的前景在很大程度上仍然未知。 為了更清楚地瞭解TNTs的作用，有必要了解通過TNTs的通信如何受到不同治療情況的影響，例如不同類型的輻射或使用不同的化療藥物。
本研究調查了化療藥物對U87 MG膠質母細胞瘤細胞系中通過TNTs的細胞通信的影響。 我們使用了膠質母細胞瘤治療中常用的藥物TMZ，並選擇阿糖胞苷（AraC）作為第二種化療藥物來分析其對通過TNTs的細胞通信的影響，原因有二。 首先，據報導，AraC在1 μM濃度下孵育24小時后可抑制白血病細胞中的TNTs，其次，AraC也在膠質母細胞瘤治療的背景下進行研究，因為這種化療藥物也能穿過血腦屏障。 兩種選擇的化療藥物都會破壞DNA複製。 TMZ導致DNA甲基化，而AraC充當錯誤的DNA構建塊。 我們還使用了細胞鬆弛素B（CytoB）來調查TNTs是否可以在U87 MG細胞中被抑制，並檢查肌動蛋白在TNTs中的作用。 CytoB是一種肌動蛋白聚合抑製劑，CytoB對TNT的抑制已在許多其他細胞系中得到證實，因此它的使用除了活細胞顯微鏡圖像外，還允許對TNTs中肌動蛋白的作用得出結論。 此外，我們對TNTs的細胞骨架進行了活細胞共聚焦顯微鏡檢查，以檢查微管蛋白和/或肌動蛋白是否存在於TNTs中。 我們更喜歡活細胞成像，因為細胞固定會導致許多TNT斷裂，從而扭曲TNT網路，如先前研究所示。
結果
TNTs的細胞骨架含量
女士催情藥 (https://longscity.com/product-category/woman1/) 延時噴霧劑 (https://longscity.com/product-category/man5/) 性用品周邊 (https://longscity.com/product-category/sex/) 治療性冷感 (https://longscity.com/product-category/woman4/) 淫蕩春藥水 (https://longscity.com/product-category/woman2/) 男士催情藥 (https://longscity.com/product-category/man3/) 男士助勃藥 (https://longscity.com/product-category/mens-erection-pills/) 男士持久藥 (https://longscity.com/product-category/mens2/) 補腎壯陽藥 (https://longscity.com/product-category/man4/) 迷昏失憶型 (https://longscity.com/product-category/woman3/) 陰莖增大丸 (https://longscity.com/product-category/man6/)
我們進行了活細胞顯微鏡檢查，以檢查U87 MG細胞中TNTs的細胞骨架含量。 為此，我們同時標記了細胞的質膜、微管蛋白和肌動蛋白，如方法部分所述。 在三個獨立實驗中，總共分析了85個TNTs的細胞骨架含量。
顯微鏡圖像顯示，肌動蛋白和微管蛋白信號並不總是在微小的TNTs中可見。 圖1（a）顯示了示例性共聚焦圖像，揭示了U87 MG細胞TNTs中肌動蛋白和微管蛋白的片段化存在。 肌動蛋白在（58±8;平均值±標準差）%的TNTs中可檢測到，而微管蛋白在（24±10）%的TNTs中可檢測到。 含有微管蛋白的TNTs數量顯著較少（雙樣本t檢驗（N=3）:P=0.01）。 分析顯示，所有含有微管蛋白的TNTs也含有肌動蛋白。 因此，（24±10）%的TNTs同時含有兩種細胞骨架成分，而（34±12）%的TNTs僅含有肌動蛋白。 TNTs中的細胞骨架含量與位於細胞內部的其餘細胞骨架相比要低得多; 因此，需要圖像處理如對比度增強，才能使TNTs中的細胞骨架含量可見。 TNTs中螢光的減少表明，與細胞內部相比，TNTs中細胞骨架成分的存在減少。 細胞骨架含量的信號強度在不同TNTs之間以及沿著TNTs的長度上有所變化。 在分析中，如果在TNTs的任何位置都能檢測到信號，則將TNT視為肌動蛋白或微管蛋白陽性。
CytoB對TNT網路的影響
在我們的研究中，我們分析了CytoB對U87 MG細胞TNT網路的影響。 我們使用CellMask™橙色質膜染色劑標記U87 MG細胞，然後將藥物以0.05 μM、0.5 μM和5 μM的濃度加入，並獲取共聚焦活細胞視頻。
CytoB導致TNT連接減少，因為連接細胞的數量以及每個細胞的連接數量隨著CytoB的加入而減少。 這種效應在CytoB濃度越高時越強。 該效應在1小時的最早時間點就存在，表明網路破壞的快速機制。 在最高濃度下，1小時后僅有（29±9）%的細胞連接，與對照樣品（58±16）%相比，顯著減少了兩倍（雙樣本t檢驗; P=0.0120)。 在對照樣品中，連接細胞的百分比增加到（74±10）%。 相比之下，在所有處理樣品中，網路無法恢復。 10小時后，與對照組相比，所有添加的CytoB濃度均顯示出顯著減少（雙樣本t檢驗; 0.05 μM: P=0.0396；0.5 μM: P=0.0015；5 μM: P<0.001)。
此外，我們還通過確定高度連接細胞的數量和複雜連接的比例來評估TNT網路的複雜性。 CytoB處理導致高度連接細胞數量顯著減少（雙樣本t檢驗; P=0.0061），在最早時間點（對照：（25±11）%，5 μM：（3±4）%）。 與對照相比，使用0.5 μM和5 μM處理的樣品無法增加高度連接細胞的數量。 0.05 μM樣品顯示出輕微恢復。 此外，兩種較高濃度在後期時間點傾向於抑制複雜連接。 可以得出結論，CytoB在濃度高達0.5 μM時降低了TNT網路的複雜性。 這種效應隨著CytoB濃度的升高而增強。 在最低濃度下，可以看到立即效應，該效應在後期時間點至少部分逆轉。
TMZ和AraC對TNT網路的影響
在證明某些藥物可以持續改變網路后，我們想知道某些化療藥物是否可能產生類似效果。 我們選擇了TMZ作為膠質母細胞瘤治療的標準護理藥物，以及AraC作為有前景的新藥物，該藥物已在其他癌細胞系中用於修改TNT網路。 使用TMZ濃度為1 μM、10 μM和100 μM，AraC濃度為0.1 μM、1 μM、10 μM和100 μM。
AraC和TMZ不影響U87 MG細胞中的TNT網路。 根據重複測量的雙向方差分析，無論是在連接細胞的數量還是在每個細胞的連接數量方面，均未觀察到顯著差異。 在成像開始時，連接細胞的比例在（40±12）%到（67.0±2.1）%之間變化，與化療處理無關，在AraC處理中變異性更高。 10小時后，所有測量條件下，這一比例增加到70%至83%。 在10小時時間點，連接細胞的比例已達到平臺期，在評估長達24小時的樣品中沒有可見變化（對照和AraC 100 μM）。 連接每個細胞的分析顯示了相同的趨勢。
此外，對於任一藥物在任何濃度下，均未發現網路複雜性的明顯改變。 對於AraC，在3小時的10 μM處理和10小時的100 μM處理中，複雜連接比例的時間過程中可見兩個峰值。 根據雙樣本t檢驗，這些峰值與對照組顯著不同（P=0.0418和P=0.0194）。 然而，重複測量的雙向方差分析顯示，對於TMZ或AraC處理，在複雜連接比例或高度連接細胞數量方面均無顯著差異。
討論
本研究的首要目標是闡明體外U87 MG細胞之間TNT連接的細胞骨架含量。 我們發現肌動蛋白比微管蛋白更常見，但兩種蛋白質僅在一部分TNTs中以低濃度存在。 我們懷疑濃度太低，信號可能會消失在背景中，幾乎無法測量。 結合其小直徑和大長度，這表明TNTs是脆弱的膜結構，細胞質含量低。 在本研究中，我們還測試了CytoB是否減少膠質母細胞瘤細胞中的TNTs數量，這已在幾種其他細胞類型中報導，並且通常用於抑制TNTs。 我們的結果顯示，U87 MG膠質母細胞瘤細胞中的TNTs也被CytoB抑制，所有濃度在治療的第一小時內即出現抑制，且0.5 μM和5 μM濃度具有可持續的效果。 濃度越高，效果越強。 因此，我們的結果與其他關於TNTs的報導一致，表明肌動蛋白對這些膜結構很重要。
肌動蛋白聚合抑製劑如CytoB對TNTs的抑制表明，肌動蛋白在TNT形成、穩定性或沿TNTs的可能運輸機制中起著重要作用，這已在不同細胞類型中的許多研究中進行了調查。 然而，需要進一步研究以更深入瞭解肌動蛋白或其他細胞骨架成分在膠質母細胞瘤TNTs中的作用。 負責運輸各種貨物的微管蛋白的作用，尤其需要在膠質母細胞瘤細胞中進行探索。
我們相信CytoB不適合作為TNT抑製劑用於進一步研究TNTs的功能，因為它對細胞骨架有強烈影響，這對於細胞形態、遷移和增殖無疑是必要的，因為CytoB也用作微核技術中的細胞分裂阻滯劑。 因此，單獨使用CytoB會強烈影響細胞行為，這可能導致關於通過TNTs的細胞通信的錯誤結論。 因此，在膠質母細胞瘤的進一步TNT研究中仍然缺乏TNT抑製劑。
此外，我們還認識到TNT網路表現出大的自然波動。 圖3、4和5中的大誤差條（標準差）表明單個測量變化很大。 我們想強調的是，對照曲線（黑線）是十一次獨立測量的結果，這些測量是為了更好地表徵TNT網路中的基線波動。 即使在這裡，標準差也很大，並且不顯著低於進行三次獨立實驗的其他測量。 因此，我們假設TNT網路自然高度可變。 這種高自然變異性可能會掩蓋小效應。 儘管如此，CytoB處理導致的TNT網路減少是顯而易見的，因此有可能測量TNT網路中的此類影響。
本研究的第二個主要目標是調查化療藥物對膠質母細胞瘤細胞中TNT網路的影響。 我們的結果顯示，化療藥物TMZ和AraC不影響U87 MG細胞中的TNT網路。 TMZ通常使用，AraC也在膠質母細胞瘤治療中進行研究。 兩種藥物都可以克服血腦屏障，這是膠質母細胞瘤治療的主要標準。 TMZ和AraC都會破壞腫瘤細胞中的DNA複製，從而阻斷DNA修復和細胞分裂。 AraC通常用於治療急性髓系白血病（AML）。 TNTs也涉嫌在AML治療中促進化療耐葯，因此也在該疾病的背景下進行研究。 研究發現，AraC減少了原發性AML細胞和AML細胞系中TNTs的數量。 這些結果表明，使用AraC治療AML也有效地抑制了腫瘤細胞的細胞通信，表明AraC作為治療AML的化療藥物很有前景。 本研究的結果表明，AraC似乎不能有效抑制U87 MG細胞中TNT網路的形成。
我們的結果還顯示，TMZ（膠質母細胞瘤治療中最常用的化療藥物）不影響U87 MG膠質母細胞瘤細胞中的TNTs。 Valdebenito及其同事的一項研究甚至表明TMZ增強了較大尺寸的膜連接形成。 然而，他們的分析是在比本研究更低的放大倍數下進行的，可能捕獲了明顯大於TNTs的其他膜結構。 儘管如此，目前尚不清楚膜連接（如上皮橋、微管或TNTs）如何相互關聯，這些都涉及膠質母細胞瘤細胞中的細胞通信。 因此，我們可以得出結論，TMZ似乎不會阻止通過微管或TNTs的膜隧道中的細胞通信。 這可能導致治療抵抗和預後不良。
我們認為，這些結果表明 香港龍城大藥房全部商品 (https://longscity.com/shop/) 香港龍城大藥房必買商品 (https://longscity.com/) 香港龍城中西大藥房 (https://longscity.com/) 香港龍城藥房線上訂購 (https://longscity.com/shop/) 香港龍城暢銷商品 (https://longscity.com/home-2/) 關於香港龍城大藥房 (https://longscity.com/about-us/) 香港龍城大藥房獨家資訊 (https://longscity.com/blog/)，當前膠質母細胞瘤治療中，TMZ未能沿TNTs等膜結構下調細胞通信可能是主要問題之一。 然而，這一假設需要通過進一步研究TNTs等膜結構在癌症進展中通過細胞通信的實際作用來證明。 膠質母細胞瘤細胞中的TNTs是在細胞相互遠離時形成的。 此外，TNTs經常在細胞的遷移前沿被發現。 因此，細胞遷移和通過TNTs的細胞通信似乎是相關的，因此TNTs可能促進細胞侵襲性。 為了證明這一假設，需要進一步的TNTs活細胞研究。
此外，我們的發現揭示了不同細胞類型中TNTs的多樣性。 AraC減少了AML細胞中TNTs的數量，但我們沒有看到AraC對U87 MG細胞中TNT網路的影響。 這表明我們需要意識到，關於一種細胞類型中TNTs的發現不一定適用於其他細胞類型中的TNTs。 AraC對U87 MG細胞中TNTs缺乏抑制的潛在解釋可能是AML細胞和膠質母細胞瘤細胞之間觀察到的TNT形成類型不同。 TNTs在AML細胞中通過絲狀偽足生長形成，而在膠質母細胞瘤細胞中則通過細胞運動形成。 這些觀察表明，TNT形成的潛在機制可能在AML和膠質母細胞瘤細胞之間有所不同。
治療組和對照組之間每個視野的細胞數量沒有顯著差異。 對照組中的細胞數量隨時間略有增加（從1小時后的40±11個細胞到24小時后的62±17個細胞），而處理組中的細胞數量幾乎保持不變，表明細胞毒性效應。 這表明觀察到的缺乏效應並非由於細胞脫落導致的細胞數量減少而人為造成。 此外，我們使用了廣泛的濃度範圍，並且在整個實驗過程中藥物都存在於培養基中。 因此，缺乏觀察到的效應可能並非由於使用了不適當的藥物濃度或暴露時間。
當然，本研究並非沒有局限性。 首先，它使用單一細胞系，不能充分代表膠質母細胞瘤的異質性。 然而，本研究的主要目標是提供關於TNT介導的細胞通信的基本機制見解，而不是直接調查臨床相關性。 需要進一步研究來驗證本研究的發現，包括使用更能反映膠質母細胞瘤異質性的患者來源的膠質母細胞瘤細胞進行實驗。