雄激素受體活性前列腺癌向神經內分泌前列腺癌的明確定義細胞重程式設計

[jlee42]

神經內分泌前列腺癌（NEPC）主要通過神經內分泌轉分化（NEtD）作為治療耐葯的適應性機制。 目前缺乏明確研究雄激素受體（AR）信號與神經內分泌譜系程式相互作用的模型。 我們採用細胞重程式設計策略，通過候選因數將AR活性前列腺癌（ARPC）直接轉化為AR非依賴性NEPC。 我們闡明瞭先鋒因數ASCL1和NeuroD1在NEtD中的核心作用，發現其可通過重塑體細胞獲得的AR增強子及全域AR結合位點的染色質結構來沉默AR表達和信號傳導。 我們還解析了ARPC向NEPC急性譜系轉化過程中轉錄組和表觀組的動態變化，揭示了ASCL1和NeuroD1與REST失活在NEPC譜系建立及MHC I抗原呈遞基因調控中的差異功能。 這些發現為前列腺癌神經內分泌轉分化的生物學過程提供了重要的臨床相關見解。
引言
前列腺癌是一種由雄激素受體（AR）信號驅動的疾病。 雄激素剝奪治療（ADT）和AR信號抑製劑（ARSIs）是晚期前列腺癌的標準療法。 儘管初始治療有效，但最終會發展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC），其耐葯機制包括AR基因突變、擴增、選擇性剪接及增強子重複等異常再啟動。 此外，譜系可塑性作為更極端的適應機制，在前列腺癌和其他上皮性惡性腫瘤中普遍存在。 其中AR活性前列腺癌（ARPC）向神經內分泌前列腺癌（NEPC）的轉分化尤為典型，其特徵是AR程式被神經內分泌程式取代，導致AR非依賴性耐葯。
多項研究發現NEtD與MYCN擴增、REST失活、PTEN、TP53和RB1丟失相關。 儘管已有基於人前列腺上皮轉化模型的研究，但現有模型始於AR缺失的基底細胞，無法闡明AR調控的譜系承諾如何被抑制。 目前最常用的研究模型是LTL-331 ARPC患者源性異種移植（PDX）模型，其在去勢小鼠中傳代后可轉變為LTL-331R NEPC模型。 雖然反覆活檢提供了NEtD相關分子程序的見解，但該模型的實驗操作性較差。
另一個挑戰在於NEPC定義的不一致性。 臨床診斷依賴於組織學形態和NE標誌物（如CHGA、SYP、CD56）表達。 實驗研究中廣泛使用的NE標誌物表達和類神經突起形成等表型可能無法準確反映與ARPC分化的癌譜系狀態。 例如雙表型前列腺癌（AMPC）同時表達AR和NE標誌物，但對恩雜魯胺敏感，表明其仍依賴AR驅動程式。
我們建立了可在指定時間過程中可重複、穩定將ARPC細胞系轉化為NEPC的體外系統。 該系統重現了NEtD的關鍵特徵，包括全域性轉錄和表觀遺傳重程式設計。 我們發現神經先鋒轉錄因數ASCL1和NeuroD1能夠通過重塑雄激素受體增強子及全域AR結合位點的染色質可及性來抑制AR表達和信號傳導。 單細胞測序數據表明AR和ASCL1/NeuroD1活性在個體癌細胞中可能互斥，這解釋了NEPC僅出現在15%的治療耐葯病例中。 研究還區分了SRRM4與ASCL1/NeuroD1在NE重程式設計中的相對貢獻，揭示了依賴少數標誌物定義NEPC譜系狀態的局限性。
結果
候選因數直接重程式設計ARPC為NEPC並繞過AR信號依
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賴
我們建立了NEtD檢測系統，將包含顯性失活TP53、靶向RB1的shRNA、MYCN、ASCL1、SRRM4、NR0B2、BCL2和KRAS G12V的慢病毒池導入LNCaP和C4-2B細胞，並在支援NEPC生長的培養基中培養兩周后分析表型標誌物。 結果顯示AR和NKX3-1顯著下調，而NE標誌物（如FOXA2、SYP、NCAM1、INSM1、POU3F2）上調。 免疫組化分析證實候選因數LV池誘導的ARlow/-NE+表型在異種移植中具有穩定性。
為驗證重程式設計后的PC細胞是否功能上脫離AR依賴，我們實施了AR依賴性負向選擇策略。 將C4-2B細胞工程化改造為ARE-FKBP-Casp8系統后，經候選因數LV池處理的細胞在嚴格選擇壓力下仍存活，表明候選因數能夠使ARPC在高度嚴格AR抑制治療背景下轉化為重現NEPC關鍵表型和功能特徵的細胞狀態。
先鋒神經轉錄因數ASCL1抑制AR程式但需要額外遺傳改變維持增殖表型
通過"剔除法"分析候選因數功能貢獻，我們發現排除ASCL1會導致AR和NKX3-1下調及FOXA2、NCAM1和INSM1表達被取消，證實ASCL1在NE轉分化中的關鍵作用。 相比之下，排除SRRM4恢復REST表達但未顯著影響AR。 ASCL1單獨表達即可下調AR標誌物並誘導NE標誌物，而PRNB因數（顯性失活TP53 H175R、shRB1、MYCN和BCL2）不足以強加NEtD。 SRRM4單獨處理導致REST失活和SYP表達但未降低AR標誌物。 單細胞DNA擴增測序顯示，97.8%的細胞攜帶所有條碼，表明轉導效率良好。
細胞增殖分析顯示PRNB顯著增強增殖而ASCL1對細胞存活有害，這與ASCL1在神經祖細胞和膠質母細胞瘤幹細胞中促進細胞週期退出的研究結果一致。 有趣的是，SRRM4促進增殖但無法在缺乏PRNB時逆轉ASCL1的影響，表明遺傳背景和增殖適應性的平衡對NEPC發生至關重要。
NeuroD1具有誘導神經內分泌譜系重程式設計的能力
基於轉錄組分析，我們發現NeuroD1與ASCL1共同定義NEPC分子亞型。 用NeuroD1替代或與ASCL1聯用進行重程式設計實驗顯示，NeuroD1與PRNB和SRRM4組合可顯著降低AR標記並提高NE標記。 RNA-seq分析證實PRNBSA（ASCL1）和PRNBSN（NeuroD1）條件下AR基因特徵富集顯著減少而NE基因特徵富集增加。 在獨立的ARPC細胞系MDA PCa 2b中驗證了這些發現。
部分神經轉錄因數（如FOXA2、INSM1、POU3F2、SOX2）的單獨表達不足以誘導NE譜系重程式設計，提示ASCL1和NeuroD1位於NE相關轉錄因數層級頂端。 PLS-DA分析顯示PRNB和PRNBS條件未引起NEPC錶型顯著轉變，而添加ASCL1或NeuroD1后觀察到從ARPC到NEPC的急劇基因表達程序轉變。
細胞重程式設計過程中癌症表型、轉錄和表觀遺傳景觀的動態變化
時間進程分析顯示AR標誌物（AR和NKX3-1）在D2即顯著下調，NE標誌物INSM1和FOXA2在D4-5出現。 時間進程RNA-seq分析證實AR程序下調先於NE程式建立。 PCA分析顯示PRNBSA和PRNBSN處理組在NEtD過程中呈現弧形軌跡，這與正常組織和癌發生中的動態變化一致。
CUT&RUN分析揭示了H3K4me1、H3K27ac和H3K4me3信號的顯著時序變化，表明譜系重程式設計伴隨表觀遺傳重組。 ASCL1結合和表達時間依賴性變化分析顯示，早期（D2）涉及CDC25、TGFβ1等不穩定轉錄狀態，晚期（D8-14）與PRC2靶點和神經命運承諾途徑富集相關。
ASCL1/NeuroD1通過重塑AR增強子染色質可及性抑制AR表達
單細胞多組學分析顯示PRNBSA和PRNBSN條件下AR體細胞獲得的增強子區域染色質可及性顯著降低，而AR基因體未見此變化。 臨床標本分析顯示混合AR+/ASCL1-和AR-/ASCL1+腫瘤細胞中AR增強子可及性存在顯著差異。 全域AR結合位點分析顯示具有增強子活性的ARBS可及性從PRNB到PRNBSA/PRNBSN呈全球降低，而隨機基因組區域無此變化。
ASCL1/NeuroD1建立NE轉錄網路而SRRM4
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/REST失活不能
ASCL1和NeuroD1通過自激活維持自身表達。 與SRRM4相比，ASCL1/NeuroD1處理組顯著誘導NE相關轉錄因數（INSM1、SOX2、NKX2-2、FOXA2）表達。 足跡分析顯示ASCL1/NeuroD1表達與NE轉錄因數結合基序顯著富集。 偽批量scATAC-seq數據PCA投影顯示PRNBSA和PRNBSN處理組聚類於NEPC PDX模型，而PRNB和PRNBS聚類於ARPC。 NEPC相關細胞表面靶點（DLL3、L1CAM、CEACAM5、RET和SEZ6）顯著上調，而ARPC相關靶點（FOLH1、PSCA、STEAP1、TACSTD2）顯著下調。
NEPC中MHC I下調與ASCL1/NeuroD1驅動程式的功能關聯
MHC I抗原呈遞通路下調是癌症逃逸免疫監視的標誌。 我們發現NEPC具有更低的MHC I抗原加工和呈遞基因特徵評分及B2M表達。 快速屍檢標本分析和重組C4-2B細胞RNA-seq數據均顯示隨著NE分化增強，MHC I基因表達下降始於AR通路抑制。 SRRM4處理組MHC I無顯著變化，而ASCL1或NeuroD1處理組顯著下調，其中NeuroD1處理組B2M下調最明顯。 scRNA-seq和scATAC-seq數據顯示NEPC評分與B2M表達呈負相關，流式細胞術證實PRNBSN條件下B2M陽性細胞比例顯著降低。 MHC I表達下調與EZH2表達升高相關，提示PRC2複合物參與調控。 這些發現將NEPC中MHC I通路的譜系特異性下調歸因於ASCL1和NeuroD1的譜系定義轉錄因數。